Các yếu tố gây nhiễu trong phản ứng PCR

Trong quá trình phản ứng PCR thường gặp một số yếu tố cản trở.
Do độ nhạy của PCR rất cao, nhiễm bẩn được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả PCR và có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Điều quan trọng không kém là các nguồn khác nhau dẫn đến kết quả âm tính giả.Nếu một hoặc nhiều phần thiết yếu của hỗn hợp PCR hoặc bản thân phản ứng khuếch đại bị ức chế hoặc can thiệp, xét nghiệm chẩn đoán có thể bị cản trở.Điều này có thể dẫn đến giảm hiệu quả và thậm chí cho kết quả âm tính giả.
Ngoài việc ức chế, có thể xảy ra hiện tượng mất tính nguyên vẹn của axit nucleic đích do vận chuyển và/hoặc điều kiện bảo quản trước khi chuẩn bị mẫu.Đặc biệt, nhiệt độ cao hoặc bảo quản không đầy đủ có thể dẫn đến tổn thương tế bào và axit nucleic.Sự cố định tế bào và mô và nhúng parafin là những nguyên nhân phổ biến gây ra sự phân mảnh DNA và là một vấn đề dai dẳng (xem Hình 1 và 2).Trong những trường hợp này, ngay cả cách ly và thanh lọc tối ưu cũng không giúp được gì.

Hình 1 |Ảnh hưởng của cố định đến tính toàn vẹn của DNA
Điện di trên gel agarose cho thấy chất lượng của DNA được phân lập từ các phần parafin của khám nghiệm tử thi thay đổi đáng kể.DNA có độ dài đoạn trung bình khác nhau có mặt trong dịch chiết tùy thuộc vào phương pháp cố định.DNA chỉ được bảo quản khi được cố định trong các mẫu đông lạnh tự nhiên và trong chất đệm chính thức trung tính.Việc sử dụng chất cố định Bouin có tính axit mạnh hoặc formalin có chứa axit formic không đệm, dẫn đến sự mất mát đáng kể DNA.Phần còn lại bị phân mảnh cao.
Ở bên trái, độ dài của các đoạn được biểu thị bằng cặp kilobase (kbp)

Hình 2 |Mất tính toàn vẹn của các mục tiêu axit nucleic
(a) Khoảng cách 3′-5′ trên cả hai sợi sẽ dẫn đến sự đứt gãy DNA đích.sự tổng hợp DNA sẽ vẫn xảy ra trên đoạn nhỏ.Tuy nhiên, nếu vị trí ủ mồi trên đoạn DNA bị thiếu thì chỉ xảy ra quá trình khuếch đại tuyến tính.Trong trường hợp thuận lợi nhất, các mảnh có thể tái bão hòa lẫn nhau, nhưng năng suất sẽ nhỏ và dưới mức phát hiện.
(b) Mất bazơ, chủ yếu do khử purin và hình thành dime thymidine, dẫn đến giảm số lượng liên kết H và giảm Tm.Trong giai đoạn nóng lên kéo dài, các đoạn mồi sẽ tan ra khỏi DNA ma trận và sẽ không ủ ngay cả trong các điều kiện ít nghiêm ngặt hơn.
( c ) Các cơ sở thymine liền kề tạo thành một dimer TT.
Một vấn đề phổ biến khác thường xảy ra trong chẩn đoán phân tử là việc giải phóng axit nucleic đích ít hơn mức tối ưu so với chiết xuất phenol-chloroform.Trong những trường hợp cực đoan, điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính giả.Có thể tiết kiệm nhiều thời gian bằng cách đun sôi ly giải hoặc tiêu hóa các mảnh vụn tế bào bằng enzym, nhưng phương pháp này thường dẫn đến độ nhạy PCR thấp do giải phóng axit nucleic không đủ.

Ức chế hoạt động polymerase trong quá trình khuếch đại

Nói chung, sự ức chế được sử dụng như một khái niệm chứa đựng để mô tả tất cả các yếu tố dẫn đến kết quả PCR dưới mức tối ưu.Theo nghĩa sinh hóa nghiêm ngặt, sự ức chế chỉ giới hạn ở hoạt động của enzyme, nghĩa là, nó làm giảm hoặc ngăn chặn quá trình chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm thông qua tương tác với vị trí hoạt động của DNA polymerase hoặc đồng sáng lập của nó (ví dụ: Mg2+ cho Taq DNA polymerase).
Các thành phần trong mẫu hoặc các dung dịch đệm và chất chiết xuất khác nhau có chứa thuốc thử có thể trực tiếp ức chế enzym hoặc bẫy các đồng yếu tố của nó (ví dụ: EDTA), do đó làm bất hoạt polymerase và từ đó dẫn đến kết quả PCR giảm hoặc âm tính giả.
Tuy nhiên, nhiều tương tác giữa các thành phần phản ứng và axit nucleic chứa đích cũng được chỉ định là 'chất ức chế PCR'.Sau khi tính toàn vẹn của tế bào bị phá vỡ do quá trình phân lập và axit nucleic được giải phóng, tương tác giữa mẫu với dung dịch xung quanh và pha rắn có thể xảy ra.Ví dụ, 'người nhặt rác' có thể liên kết DNA sợi đơn hoặc sợi kép thông qua các tương tác không cộng hóa trị và can thiệp vào quá trình phân lập và tinh chế bằng cách giảm số lượng mục tiêu cuối cùng đến được bình phản ứng PCR.
Nói chung, chất ức chế PCR có mặt trong hầu hết các chất dịch cơ thể và thuốc thử dùng cho xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng (urê trong nước tiểu, huyết sắc tố và heparin trong máu), thực phẩm bổ sung (thành phần hữu cơ, glycogen, chất béo, ion Ca2+) và các thành phần trong môi trường (phenol). , kim loại nặng)

Các chất ức chế PCR phổ biến hơn có thể được tìm thấy trong vi khuẩn và tế bào nhân chuẩn, DNA không phải mục tiêu, các đại phân tử liên kết DNA của ma trận mô và thiết bị thí nghiệm như găng tay và nhựa.Tinh chế axit nucleic trong hoặc sau khi chiết xuất là phương pháp ưu tiên để loại bỏ chất ức chế PCR.
Ngày nay, các thiết bị khai thác tự động khác nhau có thể thay thế nhiều quy trình thủ công, nhưng chưa bao giờ đạt được khả năng phục hồi và/hoặc tinh chế 100% các mục tiêu.Các chất ức chế tiềm tàng có thể vẫn còn hiện diện trong axit nucleic tinh khiết hoặc có thể đã có tác dụng.Các chiến lược khác nhau tồn tại để giảm tác động của các chất ức chế.Việc lựa chọn polymerase thích hợp có thể có tác động đáng kể đến hoạt động của chất ức chế.Các phương pháp khác đã được chứng minh để giảm sự ức chế PCR là tăng nồng độ polymerase hoặc áp dụng các chất phụ gia như BSA.
Việc ức chế phản ứng PCR có thể được chứng minh bằng việc sử dụng kiểm soát chất lượng quy trình nội bộ (IPC).
Cần phải cẩn thận để loại bỏ tất cả thuốc thử và các dung dịch khác trong bộ chiết, chẳng hạn như etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol và phenol, khỏi axit nucleic phân lập bằng bước rửa kỹ.Tùy thuộc vào nồng độ của chúng, chúng có thể kích hoạt hoặc ức chế PCR.