Các yếu tố nhiễu trong phản ứng PCR

Trong phản ứng PCR, một số yếu tố gây nhiễu thường gặp phải.
Do độ nhạy rất cao của PCR, ô nhiễm được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả PCR và có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Quan trọng như nhau là các nguồn khác nhau dẫn đến kết quả âm tính giả. Nếu một hoặc nhiều phần thiết yếu của hỗn hợp PCR hoặc phản ứng khuếch đại bị ức chế hoặc can thiệp, xét nghiệm chẩn đoán có thể bị cản trở. Điều này có thể dẫn đến giảm hiệu quả và thậm chí kết quả âm tính giả.
Ngoài sự ức chế, mất tính toàn vẹn của axit nucleic mục tiêu có thể xảy ra do điều kiện vận chuyển và/hoặc lưu trữ trước khi chuẩn bị mẫu. Cụ thể, nhiệt độ cao hoặc lưu trữ không đầy đủ có thể dẫn đến thiệt hại của các tế bào và axit nucleic. Việc cố định tế bào và mô và nhúng parafin là nguyên nhân nổi tiếng của sự phân mảnh DNA và một vấn đề dai dẳng (xem Hình 1 và 2). Trong những trường hợp này, ngay cả sự cô lập và thanh lọc tối ưu sẽ không giúp ích gì.

Hình 1 | Ảnh hưởng của bất động đến tính toàn vẹn DNA
Điện di gel agarose cho thấy chất lượng của DNA được phân lập từ các phần parafin của khám nghiệm tử thi khác nhau đáng kể. DNA có độ dài phân đoạn trung bình khác nhau đã có trong các trích xuất tùy thuộc vào phương pháp cố định. DNA chỉ được bảo tồn khi cố định trong các mẫu đông lạnh tự nhiên và trong chính thức trung tính được đệm. Việc sử dụng một chất cố định bouin có tính axit mạnh hoặc axit formic có chứa axit formic mạnh dẫn đến mất DNA đáng kể. Phần còn lại là rất phân mảnh.
Ở bên trái, chiều dài của các mảnh được thể hiện bằng các cặp kilobase (KBP)

Hình 2 | Mất tính toàn vẹn của các mục tiêu axit nucleic
(a) Khoảng cách 3′-5 trên cả hai chuỗi sẽ dẫn đến sự phá vỡ DNA mục tiêu. Tổng hợp DNA vẫn sẽ xảy ra trên đoạn nhỏ. Tuy nhiên, nếu một vị trí ủ mồi bị thiếu trên đoạn DNA, chỉ có sự khuếch đại tuyến tính xảy ra. Trong trường hợp thuận lợi nhất, các mảnh vỡ có thể nối lại nhau, nhưng sản lượng sẽ nhỏ và thấp hơn mức phát hiện.
. Trong giai đoạn nóng lên kéo dài, các đoạn mồi sẽ tan chảy khỏi DNA ma trận và sẽ không ủ ngay cả trong điều kiện ít nghiêm ngặt hơn.
(c) Các bazơ thymine liền kề tạo thành một dimer TT.
Một vấn đề phổ biến khác thường xảy ra trong chẩn đoán phân tử là sự giải phóng ít tối ưu của các axit nucleic mục tiêu so với chiết xuất phenol-chloroform. Trong trường hợp cực đoan, điều này có thể được liên kết với các tiêu cực sai. Có thể tiết kiệm nhiều thời gian bằng cách đun sôi quá mức hoặc tiêu hóa enzyme của các mảnh vụn tế bào, nhưng phương pháp này thường dẫn đến độ nhạy PCR thấp do không đủ giải phóng axit nucleic.

Sự ức chế hoạt động polymerase trong quá trình khuếch đại

Nhìn chung, ức chế được sử dụng như một khái niệm container để mô tả tất cả các yếu tố dẫn đến kết quả PCR tối ưu. Theo nghĩa sinh hóa nghiêm ngặt, sự ức chế được giới hạn ở hoạt động của enzyme, IE, nó làm giảm hoặc ngăn ngừa chuyển đổi sản phẩm cơ chất thông qua tương tác với vị trí hoạt động của DNA polymerase hoặc đồng yếu tố của nó (EG, MG2+ cho TAQ DNA polymerase).
Các thành phần trong mẫu hoặc các bộ đệm và chiết xuất khác nhau có chứa thuốc thử có thể trực tiếp ức chế enzyme hoặc bẫy các đồng yếu tố của nó (ví dụ EDTA), do đó làm bất khả xâm phạm polymerase và đến lượt dẫn đến giảm hoặc giảm kết quả PCR âm tính giả.
Tuy nhiên, nhiều tương tác giữa các thành phần phản ứng và axit nucleic có chứa mục tiêu cũng được chỉ định là 'chất ức chế PCR'. Khi tính toàn vẹn của tế bào bị phá vỡ do sự cô lập và axit nucleic được giải phóng, sự tương tác giữa mẫu và dung dịch xung quanh và pha rắn có thể xảy ra. Ví dụ: 'Scavenger' có thể liên kết DNA chuỗi đơn hoặc hai sợi thông qua các tương tác không cộng hóa trị và can thiệp vào sự cô lập và tinh chế bằng cách giảm số lượng mục tiêu cuối cùng đạt đến mạch phản ứng PCR.
Nói chung, các chất ức chế PCR có trong hầu hết các chất lỏng và thuốc thử cơ thể được sử dụng cho các xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng (urê trong nước tiểu, hemoglobin và heparin trong máu), bổ sung chế độ ăn uống (thành phần hữu cơ, glycogen, chất béo, ion Ca2+) và các thành phần trong môi trường (phenol, kim loại nặng)

Các chất ức chế PCR phổ biến hơn có thể được tìm thấy trong vi khuẩn và tế bào nhân chuẩn, DNA không nhắm mục tiêu, các đại phân tử liên kết DNA của ma trận mô và thiết bị phòng thí nghiệm như găng tay và nhựa. Tinh chế axit nucleic trong hoặc sau khi chiết xuất là phương pháp ưa thích để loại bỏ các chất ức chế PCR.
Ngày nay, các thiết bị trích xuất tự động khác nhau có thể thay thế nhiều giao thức thủ công, nhưng phục hồi 100% và/hoặc tinh chế các mục tiêu chưa bao giờ đạt được. Các chất ức chế tiềm năng vẫn có thể có trong các axit nucleic tinh khiết hoặc có thể đã có hiệu lực. Các chiến lược khác nhau tồn tại để giảm tác động của các chất ức chế. Việc lựa chọn polymerase thích hợp có thể có tác động đáng kể đến hoạt động của chất ức chế. Các phương pháp đã được chứng minh khác để giảm ức chế PCR đang làm tăng nồng độ polymerase hoặc áp dụng các chất phụ gia như BSA.
Ức chế các phản ứng PCR có thể được chứng minh bằng cách sử dụng kiểm soát chất lượng quy trình nội bộ (IPC).
Phải cẩn thận để loại bỏ tất cả các thuốc thử và các giải pháp khác trong bộ dụng cụ chiết, chẳng hạn như ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol và phenol, từ axit nucleic phân lập bằng một bước rửa kỹ. Tùy thuộc vào nồng độ của chúng, chúng có thể kích hoạt hoặc ức chế PCR.