Các yếu tố can thiệp vào phản ứng PCR

Trong quá trình phản ứng PCR thường gặp một số yếu tố gây nhiễu.
Do độ nhạy của PCR rất cao nên ô nhiễm được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả PCR và có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Điều quan trọng không kém là các nguồn khác nhau dẫn đến kết quả âm tính giả. Nếu một hoặc nhiều phần thiết yếu của hỗn hợp PCR hoặc bản thân phản ứng khuếch đại bị ức chế hoặc bị cản trở thì xét nghiệm chẩn đoán có thể bị cản trở. Điều này có thể dẫn đến giảm hiệu quả và thậm chí cho kết quả âm tính giả.
Ngoài sự ức chế, việc mất tính toàn vẹn của axit nucleic mục tiêu có thể xảy ra do điều kiện vận chuyển và/hoặc bảo quản trước khi chuẩn bị mẫu. Đặc biệt, nhiệt độ cao hoặc bảo quản không đúng cách có thể dẫn đến tổn thương tế bào và axit nucleic. Cố định tế bào và mô và nhúng parafin là những nguyên nhân phổ biến gây ra sự phân mảnh DNA và là một vấn đề dai dẳng (xem Hình 1 và 2). Trong những trường hợp này, ngay cả việc cách ly và thanh lọc tối ưu cũng không giúp ích được gì.

Hình 1 | Ảnh hưởng của cố định đến tính toàn vẹn của DNA
Điện di trên gel agarose cho thấy chất lượng DNA phân lập từ các phần parafin của khám nghiệm tử thi thay đổi đáng kể. DNA có độ dài đoạn trung bình khác nhau hiện diện trong dịch chiết tùy thuộc vào phương pháp cố định. DNA chỉ được bảo quản khi được cố định trong các mẫu đông lạnh tự nhiên và trong chất đệm formalin trung tính. Việc sử dụng formalin cố định Bouin có tính axit mạnh hoặc không chứa axit formic dẫn đến mất DNA đáng kể. Phần còn lại bị phân mảnh cao.
Ở bên trái, độ dài của các đoạn được biểu thị bằng cặp kilobase (kbp)

Hình 2 | Mất tính toàn vẹn của các mục tiêu axit nucleic
(a) Khoảng cách 3′-5′ trên cả hai sợi sẽ dẫn đến sự đứt gãy DNA mục tiêu. quá trình tổng hợp DNA vẫn sẽ xảy ra trên đoạn nhỏ. Tuy nhiên, nếu thiếu vị trí gắn mồi trên đoạn DNA thì chỉ xảy ra khuếch đại tuyến tính. Trong trường hợp thuận lợi nhất, các mảnh có thể bão hòa lại với nhau, nhưng kết quả thu được sẽ nhỏ và dưới mức phát hiện.
(b) Mất các bazơ, chủ yếu là do quá trình khử purin và hình thành dimer thymidine, dẫn đến giảm số lượng liên kết H và giảm Tm. Trong giai đoạn làm nóng kéo dài, các mồi sẽ tan chảy khỏi DNA nền và sẽ không ủ ngay cả trong những điều kiện ít nghiêm ngặt hơn.
(c) Các bazơ thymine liền kề tạo thành dimer TT.
Một vấn đề phổ biến khác thường xảy ra trong chẩn đoán phân tử là việc giải phóng axit nucleic mục tiêu kém tối ưu so với chiết xuất phenol-chloroform. Trong trường hợp nghiêm trọng, điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Có thể tiết kiệm được nhiều thời gian bằng cách đun sôi ly giải hoặc tiêu hóa bằng enzyme các mảnh vụn tế bào, nhưng phương pháp này thường dẫn đến độ nhạy PCR thấp do giải phóng axit nucleic không đủ.

Ức chế hoạt động của polymerase trong quá trình khuếch đại

Nói chung, sự ức chế được sử dụng như một khái niệm chứa đựng để mô tả tất cả các yếu tố dẫn đến kết quả PCR dưới mức tối ưu. Theo nghĩa sinh hóa chặt chẽ, sự ức chế được giới hạn ở hoạt động của enzyme, nghĩa là nó làm giảm hoặc ngăn chặn sự chuyển đổi sản phẩm cơ chất thông qua tương tác với vị trí hoạt động của DNA polymerase hoặc đồng yếu tố của nó (ví dụ: Mg2+ đối với Taq DNA polymerase).
Các thành phần trong mẫu hoặc các chất đệm và dịch chiết khác nhau có chứa thuốc thử có thể ức chế trực tiếp enzyme hoặc bẫy các đồng yếu tố của nó (ví dụ EDTA), do đó làm bất hoạt polymerase và từ đó dẫn đến kết quả PCR âm tính giả hoặc giảm.
Tuy nhiên, nhiều tương tác giữa các thành phần phản ứng và axit nucleic chứa mục tiêu cũng được chỉ định là 'chất ức chế PCR'. Khi tính toàn vẹn của tế bào bị phá vỡ do quá trình phân lập và axit nucleic được giải phóng, sự tương tác giữa mẫu với dung dịch xung quanh và pha rắn có thể xảy ra. Ví dụ, 'kẻ nhặt rác' có thể liên kết DNA chuỗi đơn hoặc chuỗi kép thông qua các tương tác không cộng hóa trị và cản trở quá trình phân lập và tinh chế bằng cách giảm số lượng mục tiêu cuối cùng tiếp cận được bình phản ứng PCR.
Nhìn chung, chất ức chế PCR có mặt trong hầu hết các dịch cơ thể và thuốc thử dùng cho xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng (urê trong nước tiểu, huyết sắc tố và heparin trong máu), thực phẩm bổ sung (thành phần hữu cơ, glycogen, chất béo, ion Ca2+) và các thành phần trong môi trường (phenol). , kim loại nặng)

Các chất ức chế PCR phổ biến hơn có thể được tìm thấy ở vi khuẩn và tế bào nhân chuẩn, DNA không phải mục tiêu, các đại phân tử gắn DNA của ma trận mô và thiết bị thí nghiệm như găng tay và nhựa. Tinh chế axit nucleic trong hoặc sau khi chiết là phương pháp được ưu tiên để loại bỏ chất ức chế PCR.
Ngày nay, nhiều thiết bị chiết xuất tự động khác nhau có thể thay thế nhiều quy trình thủ công, nhưng chưa bao giờ đạt được mức phục hồi và/hoặc tinh chế mục tiêu 100%. Các chất ức chế tiềm tàng có thể vẫn còn hiện diện trong axit nucleic đã được tinh chế hoặc có thể đã có tác dụng. Có nhiều chiến lược khác nhau để giảm tác động của chất ức chế. Việc lựa chọn polymerase thích hợp có thể có tác động đáng kể đến hoạt động của chất ức chế. Các phương pháp đã được chứng minh khác để giảm sự ức chế PCR là tăng nồng độ polymerase hoặc áp dụng các chất phụ gia như BSA.
Sự ức chế phản ứng PCR có thể được chứng minh bằng cách sử dụng biện pháp kiểm soát chất lượng quy trình nội bộ (IPC).
Phải cẩn thận để loại bỏ tất cả thuốc thử và các dung dịch khác trong bộ chiết, chẳng hạn như ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol và phenol, khỏi mẫu axit nucleic phân lập bằng bước rửa kỹ. Tùy thuộc vào nồng độ của chúng, chúng có thể kích hoạt hoặc ức chế PCR.