Các yếu tố can thiệp trong phản ứng PCR

Trong phản ứng PCR, thường gặp phải một số yếu tố gây nhiễu.
Do độ nhạy rất cao của PCR, sự nhiễm bẩn được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả PCR và có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Cũng quan trọng không kém là các nguồn khác nhau dẫn đến kết quả âm tính giả. Nếu một hoặc nhiều thành phần thiết yếu của hỗn hợp PCR hoặc bản thân phản ứng khuếch đại bị ức chế hoặc can thiệp, xét nghiệm chẩn đoán có thể bị cản trở. Điều này có thể dẫn đến giảm hiệu quả và thậm chí là kết quả âm tính giả.
Ngoài sự ức chế, tính toàn vẹn của axit nucleic mục tiêu có thể bị mất do điều kiện vận chuyển và/hoặc bảo quản trước khi chuẩn bị mẫu. Đặc biệt, nhiệt độ cao hoặc bảo quản không đúng cách có thể dẫn đến tổn thương tế bào và axit nucleic. Cố định tế bào và mô, cũng như nhúng parafin là những nguyên nhân phổ biến gây phân mảnh DNA và là một vấn đề dai dẳng (xem Hình 1 và 2). Trong những trường hợp này, ngay cả việc phân lập và tinh sạch tối ưu cũng không giúp ích gì.

Hình 1 | Ảnh hưởng của việc cố định đến tính toàn vẹn của DNA
Điện di gel agarose cho thấy chất lượng DNA phân lập từ các lát parafin của tử thi thay đổi đáng kể. DNA có độ dài đoạn trung bình khác nhau trong các chiết xuất tùy thuộc vào phương pháp cố định. DNA chỉ được bảo quản khi cố định trong mẫu đông lạnh tự nhiên và trong dung dịch formalin trung tính đệm. Việc sử dụng chất cố định Bouin có tính axit mạnh hoặc formalin không đệm, chứa axit formic dẫn đến tổn thất đáng kể DNA. Phần DNA còn lại bị phân mảnh cao.
Ở bên trái, độ dài của các đoạn được thể hiện bằng cặp kilobase (kbp)

Hình 2 | Mất tính toàn vẹn của các mục tiêu axit nucleic
(a) Khoảng trống 3′-5′ trên cả hai mạch sẽ dẫn đến đứt gãy DNA đích. Quá trình tổng hợp DNA vẫn diễn ra trên đoạn DNA nhỏ. Tuy nhiên, nếu thiếu vị trí gắn mồi trên đoạn DNA, quá trình khuếch đại tuyến tính chỉ xảy ra. Trong trường hợp thuận lợi nhất, các đoạn DNA có thể bão hòa lẫn nhau, nhưng sản lượng sẽ nhỏ và dưới mức phát hiện.
(b) Sự mất bazơ, chủ yếu do quá trình khử purin và hình thành dimer thymidine, dẫn đến giảm số lượng liên kết H và giảm Tm. Trong pha làm ấm kéo dài, các đoạn mồi sẽ tan chảy khỏi DNA nền và sẽ không bắt cặp ngay cả trong điều kiện ít nghiêm ngặt hơn.
(c) Các bazơ timin liền kề tạo thành một dimer TT.
Một vấn đề phổ biến khác thường xảy ra trong chẩn đoán phân tử là việc giải phóng axit nucleic mục tiêu kém hiệu quả hơn so với chiết xuất bằng phenol-chloroform. Trong những trường hợp nghiêm trọng, điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Phương pháp ly giải ở nhiệt độ sôi hoặc tiêu hóa bằng enzyme các mảnh vụn tế bào có thể tiết kiệm được nhiều thời gian, nhưng phương pháp này thường dẫn đến độ nhạy PCR thấp do giải phóng axit nucleic không đủ.

Sự ức chế hoạt động của polymerase trong quá trình khuếch đại

Nhìn chung, ức chế được sử dụng như một khái niệm bao hàm để mô tả tất cả các yếu tố dẫn đến kết quả PCR không tối ưu. Theo nghĩa sinh hóa thuần túy, ức chế chỉ giới hạn ở hoạt động của enzyme, tức là nó làm giảm hoặc ngăn chặn quá trình chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm thông qua tương tác với vị trí hoạt động của DNA polymerase hoặc cofactor của nó (ví dụ: Mg2+ đối với Taq DNA polymerase).
Các thành phần trong mẫu hoặc các chất đệm và chiết xuất khác nhau có chứa thuốc thử có thể ức chế trực tiếp enzyme hoặc giữ lại các cofactor của nó (ví dụ EDTA), do đó làm bất hoạt polymerase và dẫn đến kết quả PCR giảm hoặc âm tính giả.
Tuy nhiên, nhiều tương tác giữa các thành phần phản ứng và axit nucleic chứa mục tiêu cũng được gọi là 'chất ức chế PCR'. Khi tính toàn vẹn của tế bào bị phá vỡ do quá trình phân lập và axit nucleic được giải phóng, tương tác giữa mẫu và dung dịch xung quanh cũng như pha rắn có thể xảy ra. Ví dụ, 'chất dọn dẹp' có thể liên kết DNA mạch đơn hoặc mạch kép thông qua các tương tác không cộng hóa trị, gây trở ngại cho quá trình phân lập và tinh sạch bằng cách làm giảm số lượng mục tiêu cuối cùng tiếp cận được bình phản ứng PCR.
Nhìn chung, chất ức chế PCR có trong hầu hết các chất dịch cơ thể và thuốc thử được sử dụng cho các xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng (urê trong nước tiểu, hemoglobin và heparin trong máu), thực phẩm bổ sung (thành phần hữu cơ, glycogen, chất béo, ion Ca2+) và các thành phần trong môi trường (phenol, kim loại nặng)

Các chất ức chế PCR phổ biến hơn có thể được tìm thấy trong vi khuẩn và tế bào nhân chuẩn, DNA không phải mục tiêu, các đại phân tử liên kết DNA của ma trận mô và thiết bị phòng thí nghiệm như găng tay và nhựa. Phương pháp ưu tiên để loại bỏ chất ức chế PCR là tinh chế axit nucleic trong hoặc sau khi chiết xuất.
Ngày nay, nhiều thiết bị chiết xuất tự động có thể thay thế nhiều quy trình thủ công, nhưng việc thu hồi và/hoặc tinh sạch 100% các mục tiêu vẫn chưa bao giờ đạt được. Các chất ức chế tiềm năng có thể vẫn còn trong axit nucleic đã tinh sạch hoặc có thể đã phát huy tác dụng. Có nhiều chiến lược khác nhau để giảm tác động của chất ức chế. Việc lựa chọn polymerase phù hợp có thể có tác động đáng kể đến hoạt tính của chất ức chế. Các phương pháp đã được chứng minh khác để giảm ức chế PCR là tăng nồng độ polymerase hoặc sử dụng các chất phụ gia như BSA.
Việc ức chế phản ứng PCR có thể được chứng minh bằng cách sử dụng kiểm soát chất lượng quy trình nội bộ (IPC).
Cần cẩn thận loại bỏ tất cả thuốc thử và các dung dịch khác trong bộ dụng cụ chiết xuất, chẳng hạn như ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol và phenol, khỏi mẫu axit nucleic phân lập bằng bước rửa kỹ. Tùy thuộc vào nồng độ, chúng có thể kích hoạt hoặc ức chế PCR.