Các yếu tố can thiệp trong phản ứng PCR

Trong phản ứng PCR, thường gặp phải một số yếu tố gây nhiễu.
Do độ nhạy rất cao của PCR nên sự nhiễm bẩn được coi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả PCR và có thể tạo ra kết quả dương tính giả.
Cũng quan trọng không kém là các nguồn khác nhau dẫn đến kết quả âm tính giả. Nếu một hoặc nhiều thành phần thiết yếu của hỗn hợp PCR hoặc bản thân phản ứng khuếch đại bị ức chế hoặc can thiệp, xét nghiệm chẩn đoán có thể bị cản trở. Điều này có thể dẫn đến giảm hiệu quả và thậm chí là kết quả âm tính giả.
Ngoài sự ức chế, mất tính toàn vẹn của axit nucleic mục tiêu có thể xảy ra do điều kiện vận chuyển và/hoặc bảo quản trước khi chuẩn bị mẫu. Đặc biệt, nhiệt độ cao hoặc bảo quản không đầy đủ có thể dẫn đến hư hỏng tế bào và axit nucleic. Sự cố định tế bào và mô và nhúng parafin là những nguyên nhân gây phân mảnh DNA và là vấn đề dai dẳng (xem Hình 1 và 2). Trong những trường hợp này, ngay cả việc cô lập và tinh chế tối ưu cũng không giúp ích được gì.

Hình 1 | Tác động của sự bất động lên tính toàn vẹn của DNA
Điện di gel agarose cho thấy chất lượng DNA được phân lập từ các phần parafin của tử thi thay đổi đáng kể. DNA có độ dài đoạn trung bình khác nhau có trong các chiết xuất tùy thuộc vào phương pháp cố định. DNA chỉ được bảo quản khi cố định trong các mẫu đông lạnh tự nhiên và trong formalin trung tính đệm. Việc sử dụng chất cố định Bouin có tính axit mạnh hoặc formalin không đệm, có chứa axit formic dẫn đến mất đáng kể DNA. Phần còn lại bị phân mảnh cao.
Ở bên trái, độ dài của các đoạn được thể hiện bằng cặp kilobase (kbp)

Hình 2 | Mất tính toàn vẹn của mục tiêu axit nucleic
(a) Khoảng cách 3′-5′ trên cả hai sợi sẽ dẫn đến sự đứt gãy trong DNA mục tiêu. Tổng hợp DNA vẫn sẽ diễn ra trên đoạn nhỏ. Tuy nhiên, nếu thiếu vị trí gắn mồi trên đoạn DNA, chỉ xảy ra khuếch đại tuyến tính. Trong trường hợp thuận lợi nhất, các đoạn có thể bão hòa lại lẫn nhau, nhưng sản lượng sẽ nhỏ và dưới mức phát hiện.
(b) Việc mất các bazơ, chủ yếu là do quá trình khử purin và hình thành dimer thymidin, dẫn đến việc giảm số lượng liên kết H và giảm Tm. Trong giai đoạn làm ấm kéo dài, các đoạn mồi sẽ tan chảy khỏi DNA ma trận và sẽ không gắn kết ngay cả trong điều kiện ít nghiêm ngặt hơn.
(c) Các bazơ timin liền kề tạo thành một dimer TT.
Một vấn đề phổ biến khác thường xảy ra trong chẩn đoán phân tử là việc giải phóng axit nucleic mục tiêu không tối ưu so với chiết xuất bằng phenol-chloroform. Trong những trường hợp cực đoan, điều này có thể liên quan đến kết quả âm tính giả. Có thể tiết kiệm được nhiều thời gian bằng cách đun sôi ly giải hoặc tiêu hóa bằng enzyme các mảnh vụn tế bào, nhưng phương pháp này thường dẫn đến độ nhạy PCR thấp do giải phóng axit nucleic không đủ.

Sự ức chế hoạt động của polymerase trong quá trình khuếch đại

Nhìn chung, sự ức chế được sử dụng như một khái niệm chứa đựng để mô tả tất cả các yếu tố dẫn đến kết quả PCR không tối ưu. Theo nghĩa sinh hóa nghiêm ngặt, sự ức chế bị giới hạn ở hoạt động của enzyme, tức là nó làm giảm hoặc ngăn chặn quá trình chuyển đổi chất nền thành sản phẩm thông qua tương tác với vị trí hoạt động của DNA polymerase hoặc cofactor của nó (ví dụ, Mg2+ đối với Taq DNA polymerase).
Các thành phần trong mẫu hoặc các chất đệm và chiết xuất khác nhau có chứa thuốc thử có thể ức chế trực tiếp enzyme hoặc giữ lại các cofactor của nó (ví dụ EDTA), do đó làm bất hoạt polymerase và dẫn đến kết quả PCR giảm hoặc âm tính giả.
Tuy nhiên, nhiều tương tác giữa các thành phần phản ứng và axit nucleic chứa mục tiêu cũng được chỉ định là 'chất ức chế PCR'. Khi tính toàn vẹn của tế bào bị phá vỡ do quá trình cô lập và axit nucleic được giải phóng, các tương tác giữa mẫu và dung dịch xung quanh và pha rắn có thể xảy ra. Ví dụ, 'chất dọn rác' có thể liên kết DNA sợi đơn hoặc sợi đôi thông qua các tương tác không cộng hóa trị và can thiệp vào quá trình cô lập và tinh chế bằng cách giảm số lượng mục tiêu cuối cùng đến được bình phản ứng PCR.
Nhìn chung, chất ức chế PCR có trong hầu hết các chất dịch cơ thể và thuốc thử được sử dụng cho các xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng (urê trong nước tiểu, hemoglobin và heparin trong máu), các chất bổ sung chế độ ăn uống (thành phần hữu cơ, glycogen, chất béo, ion Ca2+) và các thành phần trong môi trường (phenol, kim loại nặng)

Các chất ức chế PCR phổ biến hơn có thể được tìm thấy trong vi khuẩn và tế bào nhân chuẩn, DNA không phải mục tiêu, các đại phân tử liên kết DNA của ma trận mô và thiết bị phòng thí nghiệm như găng tay và nhựa. Làm sạch axit nucleic trong hoặc sau khi chiết xuất là phương pháp được ưa chuộng để loại bỏ chất ức chế PCR.
Ngày nay, nhiều thiết bị chiết xuất tự động có thể thay thế nhiều giao thức thủ công, nhưng chưa bao giờ đạt được khả năng phục hồi và/hoặc tinh chế 100% mục tiêu. Các chất ức chế tiềm năng vẫn có thể có trong các axit nucleic tinh khiết hoặc có thể đã có hiệu lực. Có nhiều chiến lược khác nhau để giảm tác động của chất ức chế. Việc lựa chọn polymerase thích hợp có thể có tác động đáng kể đến hoạt động của chất ức chế. Các phương pháp đã được chứng minh khác để giảm ức chế PCR là tăng nồng độ polymerase hoặc áp dụng các chất phụ gia như BSA.
Việc ức chế phản ứng PCR có thể được chứng minh bằng cách sử dụng kiểm soát chất lượng quy trình nội bộ (IPC).
Cần phải cẩn thận loại bỏ tất cả các thuốc thử và các dung dịch khác trong bộ dụng cụ chiết xuất, chẳng hạn như ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol và phenol, khỏi mẫu axit nucleic cô lập bằng bước rửa kỹ lưỡng. Tùy thuộc vào nồng độ của chúng, chúng có thể kích hoạt hoặc ức chế PCR.